综述：脑组织透明成像技术

2025-12-04 04:31:59

图 3：经 CUBIC 试剂处理后的小鼠大脑和成像图

3. ScaleA2/ScaleSScaleA2 是利用化学溶剂清除的一种方法，使用 ScaleA2（水溶液试剂）对固定的大脑组织进行成像，该试剂使生物样品具有光学透明性，并完全保留了荧光信号。将组织浸泡在溶剂中一周，就可以得到透明的脑组织，但是组织膨胀率高达 10%-30%。尿素溶液处理固定的脑组织，通过水合作用使组织透明，但相应的组织略膨胀，后续用 ScaleA2 溶液继续处理，ScaleA2 溶液包含 4M 尿素，10%（wt / vol）甘油和 0.1%（wt / vol）Triton X-100 组成。甘油可以防止过多的水合作用并使组织扩张最小化。在 ScaleA2 溶液中孵育完整的固定小鼠大脑，孵育时间 2 周以上可充分清除脑组织。在有图案的背景下或通过 532 nm 激光的穿透，透明性是明显的（图 4）。Scale S 方法改进了传统的配方，增加了山梨醇。山梨醇对脑的透明化更佳，尿素有水合作用，使组织膨胀，但山梨醇有脱水作用，让组织缩小，通过配比可以保留样本的原本体积。优点：操作简单，配置溶液每天更新即可。缺点：脑组织膨胀率 10%-30% 不等，影响组织原本状态，有可能破坏组织内原本结构。孵育时间长，溶液消耗大。图 4：经 ScaleA2 孵育后的组织图 5: 共聚焦成像4. BABBBABB 是使用有机溶剂如苯甲醇/苯甲酸苄酯去除脂质，从而得到透明的组织的方法。有机溶剂可以提取脂质或减少折射率的变化 [4, 5, 16]，但同时会猝灭荧光，从而限制了成像时间。此外，BABB 中天然荧光的不稳定性限制了精细神经元投射或其他易于淬灭的信号的成像。所以 BABB 等有机法由于上述缺点如今已不常使用。5. iDISCO+iDISCO+是基于 DISCO 和 3DISCO 方法的改进版本（图 6）。iDISCO+也是一种用化学试剂浸泡使组织透明的方法，与之前介绍的方法不同的是，iDISCO+先对组织进行脱水和免疫染色，之后再清除组织中的脂质使组织透明（图 7）。先用甲醇梯度脱水，之后用过氧化氢对组织进行漂白，清除溶液中含有 DCM、DBE 等，防止组织产生气泡和氧化。此种方法操作简单，但是过氧化物清除的弊端在于破坏组织完整性，会使成像结果略模糊，DCM、DBE 也会一定程度上猝灭荧光信号。iDISCO+ 常用于 10.5-16.5 天的小鼠胚胎的透明。iDISCO+ 与开发的 clearMAP 成像分析技术结合改善了成像水平，并且软件开源性使得数据分析更加容易。图 6：iDSCO\3DISCO 与 iDISCO+步骤区别图 7：小鼠全脑经透明后 LSFM 扫描成像6. PACT 和 PARSPACT 是用于完整组织的组织清除和免疫染色的方法；PARS 是一种全身清除和免疫标记的方法。在啮齿动物中，PACT、PARS 与内源性荧光、免疫组织化学、FISH 相结合，可以长期保存，并和具有细胞和亚细胞分辨率的显微镜相兼容 [17]。这些方法适用于完整器官和体内需要高分辨率和表型分析的组织器官。PACT 方法分为三步：组织与和水凝胶单体交联混合以稳定生物大分子；用离子去垢剂去除组织凝胶基质中的脂质；透明化的组织用 RIMS 包埋以成像或长期保存。这种方法的优点是对大量组织的光学扫描成像，从而能够研究细胞间的关系和远距离神经连通性。结合荧光示踪剂，组织清除有助于识别相互作用的细胞结构，包括发散或会聚的神经和脉管系统。图 8：PACT 透明及扫描成像总结与讨论目前最为常用的方法是 CLARITY、CUBIC、ScaleS 等。CLARITY 方法自 2013 年问世以来，近年来对其电泳设备及染色方法的改进，极大地缩短了透明和染色时间 [18]。并且已有稳定的商业化透明设备，透明效果好、性能稳定，是目前应用较多的一种方法。CUBIC 由于可同时进行透明和免疫染色，操作简单，不需要复杂的仪器即可完成，透明效果较好、成本较低，也是常用的方法之一。ScaleS 对原始 Scale 方法进行改造，增加了山梨醇这一成分，减少组织膨胀率，并且操作简单，只需每日更换溶液即可完成透明。但有机溶剂法对荧光信号的淬灭较为严重，故而不常使用。总的来说，透明化技术日益成熟，通过透明化可以实现大组织的透视以及多重免疫化学标记，甚至可以对神经细胞之间的相互作用立体成像，是神经科学领域研究强有力的技术手段。参考文献：